El Splicing Alternativo

El splicing alternativo contribuye a generar una gran diversidad proteica a partir de un número limitado de genes. Hallazgos recientes justifican un renovado interés en este proceso, el cual se estima que afecta a más del 90% de los genes humanos. Por consiguiente, el splicing alternativo es más una regla que una excepción entre los mecanismos de expresión genética de nuestras células. Mutaciones que afectan a secuencias reguladoras del splicing alternativo son una fuente muy amplia de enfermedades humanas. En efecto, muchas enfermedades hereditarias y cánceres son causados por mutaciones que alteran la función de secuencias reguladoras del splicing alternativo. Además, este mecanismo es particularmente importante en el desarrollo del sistema nervioso. La regulación del splicing alternativo no sólo depende de la interacción de factores de splicing con sus secuencias “blanco” en el precursor del RNA mensajero (premRNA), sino también, como le ocurre a otras reacciones de procesamiento del pre-mRNA, está acoplada a la transcripción por la RNA polimerasa II.

La investigación del grupo está focalizada en la regulación del splicing alternativo, con un énfasis particular en los mecanismos que acoplan las maquinarias de transcripción y de splicing. El grupo estudia cómo cambios en la velocidad de elongación transcripcional y en el reclutamiento de factores de splicing a la RNA polimerasa afectan al splicing alternativo y contribuyen a la generación de múltiples variantes de proteínas a partir de un único gen.

Acoplamiento de la transcripción con el splicing alternativo

La elongación transcripcional y el reclutamiento de factores pueden contribuir independiente o concertadamente al control transcripcional del splicing alternativo. Hemos desmostrado que para aproximadamente un 80% de los eventos de splicing alternativo que se ven afectados por la elongación en células humanas, a mayor velocidad de elongación, menor inclusión del exón alternativo. Desciframos el mecanismo por el cual se observa el efecto opuesto en el 20% restante de los eventos sensibles a elongación.

Cromatina y splicing alternativo

El contexto cromatínico afecta la tasa de elongación de Pol II, lo que a su vez modifica el splicing alternativo. Encontramos que, al modificar las modificaciones postraduccionales de las histonas, señales externas a las células regulan el splicing alternativo como consecuencia de cambios en la estructura de la cromatina. Una cromatina más laxa permite mayor tasa de elongación de la transcripción y, por ende, afecta eventos de splicing alternativo de diversos genes. Efectos opuestos se obervan con una estructura más compacta de la cromatina.

Cromatina, splicing alternativo y atrofia muscular espinal (AME)

La atrofia muscular espinal (AME) es un trastorno genético de las neuronas motoras que es la principal causa genética de mortalidad infantil y es causada pormutaciones del gen SMN1. En individuos sanos, SMN1 codifica la proteína survival of motor neuron (SMN), que desempeña un papel crucial en el sistema nervioso. Los humanos tenemos un parálogo de SMN1, llamado SMN2. Debido a diferencias de secuencia, el exón 7 de SMN2 (E7) es poco incluido en su ARNm lo que hace que solo el 10-20% de los transcriptos de SMN2 codifiquen la proteína de longitud completa. Por lo tanto, en ausencia de expresión de SMN1, SMN2 no puede compensar la deficiencia en la proteína SMN. El Dr. Adrian Krainer (CSHL, Nueva York) desarrolló una terapia para AME aprobada en diciembre de 2016. Krainer diseñó un poderoso oligonucleótido antisentido (ASO), de nombre comercial Spinraza, que promueve la inclusión de E7 en el transcripto de SMN2, en células, animales y pacientes. Spinraza interactúa con una secuencia localizada en el intrón que sigue a E7 (intrón 7), que es el sitio de unión de los factores de splicing negativos hnRNPA1 y A2. Cuando el sitio de unión hnRNPA1 / A2 es bloqueado por el ASO, la inclusión de E7 en el ARNm aumenta y se producen niveles más altos de proteína SMN de longitud completa.

La epigenética se refiere a cambios en la metilación del ADN y / o modificaciones post-traduccionales de histonas que regulan los patrones de expresión génica sin alterar las secuencias de ADN. Hemos encontrado, tanto en células HEK293 como en fibroblastos de pacientes con AME, que la elongación transcripcional rápida, causada por la relajación de la cromatina debida a la acetilación de histonas, promueve la inclusión de SMN2 E7 y que el uso combinado inhibidores de deacetilasas de histonas (HDAC) como la tricostatina A (TSA) o el ácido valproico (VPA) y ASOs similares a Spinraza regulan de forma sinérgica la inclusión de E7. También observamos que la administración combinada de ASO similar a Spinraza y TSA tiene fuertes efectos sinérgicos sobre el crecimiento y la supervivencia de los ratones con AME.

Estos trabajos son posibles gracias al apoyo de Familias Atrofia Muscular Argentina (FAME) y CureSMA de EEUU.

Noche y día en las plantas

Usamos la planta modelo Arabidopsis thaliana para investigar el mecanismo por el cual las condiciones de luz/oscuridad afectan el splicing alternativo. Encontramos que el cloroplasto responde a la luz generando una señal retrógrada que actúa en el núcleo en la regulación del splicing alternativo de determinados genes. Demostramos que la regulación del splicing alternativo en plantas involucra una relación inesperada entre la fotosíntesis, que ocurre en el cloroplasto, y el splicing alternativo, que ocurre en el núcleo de la célula vegetal, mediante lo que se conoce como señalización retrógrada, iniciada por el grado de oxidación de las plastoquinonas del transporte electrónico fotosintético.

Comprobamos también que la regulación del splicing alternativo por acción de la luz en plantas responde al modelo cinético de acoplamiento descripto originalmente en células animales. Encontramos que, en presencia de luz, aumenta la velocidad de elongación de la RNAPII, mientras que en oscuridad la elongación es más lenta y esto, a su vez, regula el splicing alternativo de un conjunto de genes. Esto demuestra que el acoplamiento es importante para la respuesta a un estímulo ambiental a nivel de un organismo entero.

Técnicas usadas regularmente en el laboratorio

- Biología molecular básica (clonado, marcado, hibridación, electroforesis en geles de agarosa y de poliacrilamida, PCR, RT-PCR, PCR en tiempo real) / - Cultivo de células de mamíferos / - Transfecciones de células con DNA y con RNA / - Interferencia por RNA / - Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) / - Ensayo de accesibilidad de cromatina por MspI / - ChIP-seq / - Western blotting / - Inmunofluorescencia / - Ensayo de protección a la Rnasa (RPA) / - Ensayo de Run-on / - Expresión de genes usando RNA polimerasas mutantes resistentes a alfa-amanitina / - Manipulaciones básicas de Arabidopsis