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DFBMC + IFIBYNE-CONICET, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires, Argentina.

Regulación del splicing alternativo del RNA mensajero

Regulación del Splicing Alternativo

El Splicing Alternativo

El splicing alternativo contribuye a generar una gran diversidad proteica a partir de un número limitado de genes. Hallazgos recientes justifican un renovado interés en este proceso, el cual se estima que afecta a 90% de los genes humanos. Por consiguiente, el splicing alternativo es más una regla que una excepción entre los mecanismos de expresión genética de nuestras células. Mutaciones que afectan a secuencias reguladoras del splicing alternativo son una fuente muy amplia de enfermedades humanas. En efecto, muchas enfermedades hereditarias y cánceres son causados por mutaciones que alteran la función de secuencias reguladoras del splicing alternativo. Además, este mecanismo es particularmente importante en el desarrollo del sistema nervioso. La regulación del splicing alternativo no sólo depende de la interacción de factores de splicing con sus secuencias “blanco” en el precursor del RNA mensajero (premRNA), sino también, como le ocurre a otras reacciones de procesamiento del pre-mRNA, está acoplada a la transcripción por la RNA polimerasa II.

La investigación del grupo está focalizada en la regulación del splicing alternativo, con un énfasis particular en los mecanismos que acoplan las maquinarias de transcripción y de splicing. El grupo estudia cómo cambios en la velocidad de elongación transcripcional y en el reclutamiento de factores de splicing a la RNA polimerasa afectan al splicing alternativo y contribuyen a la generación de múltiples variantes de proteínas a partir de un único gen.

Para saber más sobre el splicing alternativo y su rol en enfermedades, visitar:

http://www.eurasnet.info/alternative-splicing

Acoplamiento de la transcripción con el splicing alternativo

La elongación transcripcional y el reclutamiento de factores pueden contribuir independiente o concertadamente al control transcripcional del splicing alternativo. Estamos llevando a cabo investigaciones sobre distintos mecanismos que controlan el splicing alternativo en células de mamíferos y en plantas.

Cromatina I

El contexto cromatínico afecta la tasa de elongación de Pol II, lo que a su vez modifica el splicing alternativo. Encontramos que la despolarización de membrana en células nerviosas afecta el splicing alternativo del pre-mRNA de NCAM mediante la acetilación intragénica de histonas que relaja la cromatina permitiendo mayor elongación transcripcional.

Cromatina II

Encontramos que RNAs pequeños de interferencia (small interfering RNAs, siRNAs) dirigidos contra el intrón río abajo de un exón alternativo afectan el splicing alternativo a través de un mecanismo conocido como silenciamiento génico transcripcional (transcriptional gene silencing, o TGS). Los siRNAs intrónicos gatillan la heterocromatinización en los sitios blanco en el DNA por medio de la dimetilación de la lisina 9 de la histona H3 (H3K9me) y consecuente inhibición de la elongación transcripcional, que a su vez afecta el splicing alternativo. El efecto de los siRNAs intrónicos sobre el splicing alternativo no está relacionado con el silenciamiento génico post-transcripcional. Encontramos que la proteína argonauta AGO1 es necesaria para obtener este efecto sobre la estructura cromatínica. Estamos llevando a cabo un estudio sistemático para identificar en el genoma humano sitios blanco de AGO1 con un rol en el control del splicing alternativo por siRNAs.

Orden de remoción de intrones

Estudiamos el orden relativo de remoción de los intrones que rodean un exón alternativo y encontramos que el intrón río abajo del exón es eliminado preferentemente antes del intrón río arriba. Mutaciones en cis y factores en trans que aumentan la inclusión del exón por distintas vías afectan el orden de remoción de intrones de manera consistente con sus mecanismos de acción. Sin embargo la reducción de la elongación transcripcional, que también aumenta la inclusión de este exón, no modifica el orden de remoción de intrones. Proponemos que en lugar de promover la escisión del intrón río arriba, una baja elongación de Pol II crea el compromiso de un patrón de splicing de inclusión antes de que se sintetice el intrón río abajo. Para poner a prueba esta hipótesis estamos analizando el reclutamiento del factor de splicing U2AF al sitio de splicing 3’ del intrón río arriba en distintas condiciones.

Noche y día en las plantas

Usamos la planta modelo Arabidopsis thaliana para investigar el mecanismo por el cual las condiciones de luz/oscuridad afectan el splicing alternativo. Encontramos que el cloroplasto responde a la luz generando una señal retrógrada que actúa en el núcleo en la regulación del splicing alternativo de determinados genes. Tanto el peróxido de hidrógeno como la sacarosa reproducen los efectos de la luz en el splicing alternativo, lo que sugiere un rol de la señalización por azúcares pero no elimina la posibilidad de que las especies reactivas de oxígeno generadas en el cloroplasto cumplan algún papel. En colaboración con el grupo de Marcelo Yanovsky en el Instituto Leloir de Buenos Aires encontramos que una enzima que metila proteínas del spliceosoma es esencial para el correcto mantenimiento del ritmo circadiano en Arabidopsis y Drosophila. Esta enzima estaría involucrada en el control del splicing alternativo de genes relacionados con el reloj celular.

Técnicas usadas regularmente en el laboratorio

- Biología molecular básica (clonado, marcado, hibridación, electroforesis en geles de agarosa y de poliacrilamida, PCR, RT-PCR, PCR en tiempo real) / - Cultivo de células de mamíferos / - Transfecciones de células con DNA y con RNA / - Interferencia por RNA / - Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) / - Ensayo de accesibilidad de cromatina por MspI / - ChIP-seq / - Western blotting / - Inmunofluorescencia / - Ensayo de protección a la Rnasa (RPA) / - Ensayo de Run-on / - Expresión de genes usando RNA polimerasas mutantes resistentes a alfa-amanitina / - Manipulaciones básicas de Arabidopsis